Bei seiner nächtlichen Streife durch die kleine Stadt Sparta im US-Bundesstaat Mississippi findet der Polizist Sam Wood den Industriellen Philip Colbert ermordet auf.

Bill Gillespie, Spartas neuer Polizeichef, gibt daraufhin Anweisung, verdächtige Personen sofort festzunehmen. Gegen Morgen erscheint Wood mit Virgil Tibbs auf der Polizeistation. Er hat den gut gekleideten Schwarzen auf dem Bahnhof aufgegriffen. Tibbs gibt an, er habe seine Mutter besucht und wieder abreisen wollen, im Übrigen sei er Polizeibeamter in Philadelphia.

Als sich seine Angaben bestätigen, muss man Tibbs wieder freilassen. Der erfahrene Kriminalist ist Spezialist für die Aufklärung von Gewaltverbrechen, also jemand, wie ihn Chief Gillespie, der noch nie in einem Mordfall ermittelt hat, dringend braucht.

Er hält jedoch - wie die meisten Weißen in Sparta - Schwarze für Menschen zweiter Klasse und kann sich nicht dazu überwinden, Tibbs um Hilfe zu bitten. Doch Leslie Colbert, die junge Witwe des Ermordeten, besteht darauf, dass Tibbs in die Ermittlungen eingeschaltet wird. Ihr imponiert, wie clever dieser einen gewissen Harvey, den die Polizei von Sparta ihr als Mörder präsentieren wollte, entlastet hat. So nimmt Virgil Tibbs in einer Stadt, die auf ihn als Schwarzen sehr feindselig reagiert, seine schwierigen Untersuchungen auf.

Norman Jewisons einflussreicher Klassiker erregte seinerzeit großes Aufsehen und wurde mit fünf Oscars ausgezeichnet, unter anderem als bester Film und für den besten Hauptdarsteller (Rod Steiger).

Regisseur Jewison schuf nicht nur einen exzellenten Kriminalfilm, sondern auch die atmosphärisch dichte und genaue Milieubeschreibung eines verschlafenen Südstaatennestes in den 1950er-Jahren. Dabei zeigt er an exemplarischen Charakteren die Strukturen rassistischer Vorurteile auf. Zugleich wurde der Film zum Modell unzähliger "Buddy"-Movies, in denen zwei ungleiche Partner lernen müssen, ihre Vorurteile zu überwinden.

Der Schauspieler Sidney Poitier, der bereits 1964 für seine Rolle in "Lilien auf dem Felde" als erster Afroamerikaner einen Oscar als bester Hauptdarsteller erhalten hatte, wurde mit "In der Hitze der Nacht" zum Superstar des US-amerikanischen Kinos. Zu seinem Selbstverständnis als Schauspieler sagte er: "Ich bin zuerst und vor allem Amerikaner. Dann bin ich Schauspieler. Und wenn man es erwähnen will, bin ich auch noch Schwarzer."